Research Abstract

定量的単細胞イメージングで判明した、1つの細菌細胞集団におけるATP濃度の相違  OPEN ブックマーク

Diversity in ATP concentrations in a single bacterial cell population revealed by quantitative single-cell imaging

2014年10月6日 Scientific Reports 4 : 6522 doi: 10.1038/srep06522 (2014)

近年の単一細胞を対象にした定量分析によって、細胞ごとの遺伝子発現レベルに大きな違いがあることが明らかになった。この発現量の違いは各細胞の生理活性や細胞運命に影響を及ぼす可能性がある。これに対し、大部分の代謝産物では、その濃度は多数の細胞のアンサンブル平均を取ることでのみ測定可能だった。アデノシン三リン酸(ATP)は極めて重要な代謝産物で、多くの細胞内反応のエネルギー源である。これまで、1つ1つの細胞におけるATPの絶対濃度についての定量測定は、信頼性の高い方法がなかったために行われていない。本研究では、遺伝子操作によって、レシオ測定式ATP特異的蛍光バイオセンサー「QUEEN」を新たに開発した。QUEENは、円順列変異の作製によって改変された蛍光タンパク質と細菌ATP結合タンパク質から構成されている。以前我々が開発したFRET型蛍光ATPバイオセンサー(Imamura et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2009)とは異なり、QUEENは細菌の増殖速度の変化に原則的に影響を受けなかった。重要なことに、QUEENの計測データから示された多数の細菌細胞の平均細胞内ATP濃度は、ホタルのルシフェラーゼを用いた分析から求めた濃度とほぼ等しかった。すなわち、QUEENは細菌細胞内ATP絶対濃度の定量に適している。最後に、単一細胞由来のQUEENシグナルをイメージングによって計測した。その結果、同一培養条件下の遺伝学的に同一な大腸菌細胞集団であっても、細胞内ATPの絶対濃度は各細胞間で著しく異なることが明らかになった。

柳沼 秀幸1,2,3,4, 河合 信之輔5,6, 田端 和仁1,7, 冨山 佳祐2, 垣塚 彰8, 小松崎 民樹5, 野地 博行1,2,3 & 今村 博臣8,9

  1. 東京大学大学院 工学系研究科
  2. 大阪大学大学院 生命機能研究科
  3. 科学技術振興機構 戦略的創造研究推進事業 CREST
  4. 理化学研究所 生命システム研究センター
  5. 北海道大学 電子科学研究所
  6. 静岡大学 理学部
  7. 科学技術振興機構 戦略的創造研究推進事業 さきがけ
  8. 京都大学大学院 生命科学研究科
  9. 京都大学 白眉センター

Recent advances in quantitative single-cell analysis revealed large diversity in gene expression levels between individual cells, which could affect the physiology and/or fate of each cell. In contrast, for most metabolites, the concentrations were only measureable as ensemble averages of many cells. In living cells, adenosine triphosphate (ATP) is a critically important metabolite that powers many intracellular reactions. Quantitative measurement of the absolute ATP concentration in individual cells has not been achieved because of the lack of reliable methods. In this study, we developed a new genetically-encoded ratiometric fluorescent ATP indicator “QUEEN”, which is composed of a single circularly-permuted fluorescent protein and a bacterial ATP binding protein. Unlike previous FRET-based indicators, QUEEN was apparently insensitive to bacteria growth rate changes. Importantly, intracellular ATP concentrations of numbers of bacterial cells calculated from QUEEN fluorescence were almost equal to those from firefly luciferase assay. Thus, QUEEN is suitable for quantifying the absolute ATP concentration inside bacteria cells. Finally, we found that, even for a genetically-identical Escherichia coli cell population, absolute concentrations of intracellular ATP were significantly diverse between individual cells from the same culture, by imaging QUEEN signals from single cells.