Research Abstract

高速原子間力顕微鏡によって可視化されたCRISPR-Cas9の実空間でのリアルタイム動態

Real-space and real-time dynamics of CRISPR-Cas9 visualized by high-speed atomic force microscopy

2017年11月10日 Nature Communications 8 : 1430 doi: 10.1038/s41467-017-01466-8 (2017)
高速原子間力顕微鏡によって可視化されたCRISPR-Cas9の実空間でのリアルタイム動態
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CRISPR関連エンドヌクレアーゼであるCas9はガイドRNAと結合し、ガイドRNAと相補的な配列をもつ二本鎖DNAを切断する。このようなCas9-RNA複合体は、ゲノム編集など、多数の応用技術に利用されている。本論文では、高速原子間力顕微鏡(HS-AFM)を用いて、機能しているCRISPR-Cas9の実空間でのリアルタイム動態を可視化した。HS-AFM動画から、apo-Cas9は予想外に柔軟なコンホメーションをとる一方、Cas9-RNA複合体は安定な構造を形成し、3次元拡散によってDNA上の標的部位を探索することが示された。また、これらの動画からCas9によるDNA切断過程がリアルタイムで可視化された。重要なことに、Cas9のHNHヌクレアーゼドメインはDNA結合の際に繰り返し動いたのち、活性部位が標的DNAの切断部位に結合した活性化型コンホメーションをとることが明らかとなった。以上のHS-AFM解析はCRISPR-Cas9の作動機構についての理解を広げるものである。

Mikihiro Shibata, Hiroshi Nishimasu, Noriyuki Kodera, Seiichi Hirano, Toshio Ando, Takayuki Uchihashi and Osamu Nureki

Corresponding Authors

柴田 幹大
金沢大学 新学術創成研究機構 革新的統合バイオ研究コア 高速バイオAFM応用研究ユニット

西増 弘志
東京大学大学院 理学系研究科 生物科学専攻

濡木 理
東京大学大学院 理学系研究科 生物科学専攻

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 binds to a guide RNA and cleaves double-stranded DNA with a sequence complementary to the RNA guide. The Cas9–RNA system has been harnessed for numerous applications, such as genome editing. Here we use high-speed atomic force microscopy (HS-AFM) to visualize the real-space and real-time dynamics of CRISPR-Cas9 in action. HS-AFM movies indicate that, whereas apo-Cas9 adopts unexpected flexible conformations, Cas9–RNA forms a stable bilobed structure and interrogates target sites on the DNA by three-dimensional diffusion. These movies also provide real-time visualization of the Cas9-mediated DNA cleavage process. Notably, the Cas9 HNH nuclease domain fluctuates upon DNA binding, and subsequently adopts an active conformation, where the HNH active site is docked at the cleavage site in the target DNA. Collectively, our HS-AFM data extend our understanding of the action mechanism of CRISPR-Cas9.

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