Research Abstract


ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes

2016年1月20日 Nature Communications 7 : 10431 doi: 10.1038/ncomms10431 (2016)

CRISPR-Casシステムは、遺伝子組換え動物の作出のための強力なツールである。しかし、相同組換えにより特定のゲノム部位にノックイン(KI)する方法は、受精卵では依然として困難である。本論文では、1本鎖オリゴデオキシヌクレオチド(ssODN)を用いたCRISPR-Casシステムにより、ラットにおける効率的な遺伝子KIを紹介している。一つ目は、1 kbのssODNを、ガイドRNA(gRNA)とCas9メッセンジャーRNAとともに注入し、ラットのThy1座位にGFP-KIを作り出した。二つ目は、2つのgRNAを2つの80bp ssODNを同時に用いて、ssODNによる末端結合を利用することで、5.5 kbの CAG-GFPベクターをRosa26座位に効率的に挿入した。また、このプロトコールによって、ヒトのSIRPA座位を含む200 kb BACをKIし、同時にラットのSirpa遺伝子をノックアウトすることができた。最後に、3つのgRNAおよび2つのssODNを用いて、58 kbのラットのCyp2d クラスターを 6.2 kbのヒトCYP2D6遺伝子に置き換えた。上記のssODNを用いたKIプロトコールは、相同組換え用アームを構築する必要がなく、あらゆる標的ゲノム部位にあらゆるドナーベクターを利用することが可能であるため、生体におけるゲノム編集操作をより平易にする。

Kazuto Yoshimi, Yayoi Kunihiro, Takehito Kaneko, Hitoshi Nagahora, Birger Voigt & Tomoji Mashimo

Corresponding Author

真下 知士
大阪大学大学院 医学系研究科 附属動物実験施設

The CRISPR-Cas system is a powerful tool for generating genetically modified animals; however, targeted knock-in (KI) via homologous recombination remains difficult in zygotes. Here we show efficient gene KI in rats by combining CRISPR-Cas with single-stranded oligodeoxynucleotides (ssODNs). First, a 1-kb ssODN co-injected with guide RNA (gRNA) and Cas9 messenger RNA produce GFP-KI at the rat Thy1 locus. Then, two gRNAs with two 80-bp ssODNs direct efficient integration of a 5.5-kb CAG-GFP vector into the Rosa26 locus via ssODN-mediated end joining. This protocol also achieves KI of a 200-kb BAC containing the human SIRPA locus, concomitantly knocking out the rat Sirpa gene. Finally, three gRNAs and two ssODNs replace 58-kb of the rat Cyp2d cluster with a 6.2-kb human CYP2D6 gene. These ssODN-mediated KI protocols can be applied to any target site with any donor vector without the need to construct homology arms, thus simplifying genome engineering in living organisms.