Research Abstract


Efficient generation of conditional knockout mice via sequential introduction of lox sites

2017年8月11日 Scientific Reports 7 : 7891 doi: 10.1038/s41598-017-08496-8


Cre/loxを用いる条件付きノックアウトは遺伝子の機能解析に不可欠である。ガイドRNAと一本鎖オリゴヌクレオチドを2セット用いるCRISPR/Casにより、同時に2つのlox配列を挿入することができる。しかし、この方法は、同一染色体の2か所に二本鎖切断を誘導して、望まない染色体欠失を引き起こすため、flox(flanked lox)率が低下した。我々は、この問題を解決するために、胚発生期の1細胞期と2細胞期に各lox配列を順次導入する方法を調べた。この順次導入する方法をマイクロインジェクション法の系およびエレクトロポレーション法の系の両方に適用した。順次のエレクトロポレーション法により、従来の同時マイクロインジェクション法と比較してflox効率が高まり、floxed対立遺伝子を持つ仔を多く得ることができた。我々は、Cre接合子を用いる順次のエレクトロポレーション法を介してCre導入遺伝子とfloxed対立遺伝子の両方を含むCre/loxマウスを直接作り出した。これにより従来の方法と比較して条件付きノックアウトマウスの作製が迅速化された。

Takuro Horii, Sumiyo Morita, Mika Kimura, Naomi Terawaki, Mihiro Shibutani and Izuho Hatada

Corresponding Author

畑田 出穂
群馬大学 生体調節研究所 付属生体情報ゲノムリソースセンター ゲノム科学リソース分野

Conditional knockout using Cre/lox is essential for functional analysis of genes. CRISPR/Cas in combination with two sets of guide RNAs and a single-stranded oligonucleotide enables simultaneous insertion of two lox sequences. However, this method induces double-strand breaks at two sites on the same chromosome, which causes an undesirable chromosomal deletion and reduces the flanked lox (flox) rate. To solve this problem, we investigated a method that sequentially introduces each lox sequence at the 1-cell and 2-cell embryonic stages, respectively. The sequential method was applied to both microinjection and electroporation systems. Sequential electroporation improved the flox efficiency compared with ordinary simultaneous microinjection, leading to a high yield of offspring with floxed alleles. Finally, we directly produced Cre/lox mice containing both the Cre transgene and floxed allele via sequential electroporation using Cre zygotes, which accelerated the generation of conditional knockout mice compared with the ordinary method.