一塩基ピリミジンPAMを標的とする小型Cas9バリアントのハイスループットな連続進化

さまざまなプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）適合性のCas9バリアントが利用可能となっているが、一部のゲノム座位、とりわけPAM配列がピリミジンに富むものは、高活性のCas9タンパク質が作用し得るものがいまだに存在しない。さらに、PAM配列を操作して適合性を広げると、オフターゲット活性が強まる場合がある。我々が指向性進化を利用して作製した4つのCas9バリアントを合わせれば、ヒトゲノムのピリミジンに富むPAM配列の大多数を標的化することが可能になる。ファージによる非連続進化とeVOLVERが支援するファージによる連続進化を用いて、小型Cas9バリアントのNme2Cas9を、一塩基ピリミジンPAM配列を認識するバリアントに進化させた。そして、標的のプロトスペーサーおよびPAMが完全に指定された機能的編集を要する一般的な選択戦略を開発した。この選択法を用いて、高活性バリアントのeNme2-T.1、eNme2-T.2、eNme2-C、およびeNme2-C.NRを進化させた。バリアントeNme2-T.1およびeNme2-T.2は、既存のバリアントと同等の編集効率でN₄TN PAMに作用することができる一方、eNme2-CおよびeNme2-C.NRはPAM要件の制約が小さく、各種ヒト細胞型での活性が同等またはそれ以上であり、N₄CN PAM配列でのオフターゲット活性が低い。