生化学：CRISPR–Cas系でCas4に補助されて起こる方向性を持ったスペーサー獲得の機構

原核生物は、外来DNA由来の配列をスペーサーとしてCRISPRアレイに組み込むことによって、可動性遺伝因子がもたらす問題に適応している。スペーサーの挿入を行うのは、Cas1–Cas2インテグラーゼ複合体である。CRISPR–Cas系のかなりの部分は、鉄–硫黄クラスターを含むCas4ヌクレアーゼを使うことによって、スペーサーが確実にPAM（protospacer adjacent motif）に隣接するDNAから獲得され、CRISPRアレイに一定方向で組み込まれるようにするので、転写されたCRISPR RNAはPAMに依存して標的探索を誘導できることになる。今回我々は、ジオバクター属細菌Geobacter sulfurreducensのタイプI-GのCRISPRによって行われ、Cas4が補助するPAM選択、スペーサーのバイオジェネシス、方向性を持った組み込みの機構について、高分解能での説明を示す。このタイプI-GのCRISPRでは、Cas4は本来的にCas1と融合してCas4/Cas1を形成している。スペーサーのバイオジェネシスの際には、PAMに埋め込まれた3′オーバーハングを持つDNA二本鎖だけがCas4/Cas1–Cas2集合を引き起こす。この過程では、PAMオーバーハングがCas4によって特異的に認識・隔離されるが、切断はされない。このような「分子の隠蔽」が、PAM側プレスペーサーが組み込みに参加するのを防ぐ。このような隔離が行われないと、PAMでないオーバーハングが宿主ヌクレアーゼによって削られ、リーダー側のCRISPRリピートに組み込まれてしまう。こうした組み込みが半分進むと、次のPAMの切除とCas4の解離が起こり、スペーサー側の組み込みが可能になる。このように、Cas4とCas1–Cas2の間の分子レベルの複雑な相互作用が、PAMを含むプレスペーサーを組み込みに選び、PAMのプロセシングのタイミングを段階的な組み込みとうまく協調させて、一定方向の組み込みを実現する。

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