PAM認識の改変による黄色ブドウ球菌CRISPR-Cas9の標的範囲の拡大

CRISPR-Cas9ヌクレアーゼはガイドRNAを利用して特定のDNA配列に作用するが、Cas9タンパク質によるPAM（protospacer adjacent motif）の認識も必要である。潜在的には、PAMが長いほどゲノム編集の特異性を向上させることができるが、Cas9オルソログが作用可能な配列の範囲が制限される。この制約を緩和する方法として、Cas9のPAM認識特異性を緩めることが考えられる。今回我々は、分子進化法を利用して黄色ブドウ球菌のCas9（SaCas9）のPAM（NNGRRT）を改変した。我々が発見したKKH SaCas9という変異体は、PAMがNNNRRTの内在性ヒト標的部位で強力なゲノム編集活性を示し、SaCas9の標的範囲を約2～4倍に増加させた。GUIDE-seqにより、野生型およびKKH SaCas9がヒト細胞で誘導するオフターゲット効果はほぼ同数であることが明らかにされた。PAMの特異性を進化させる我々の方法は構造情報を必要としないため、さまざまなCas9オルソログに適用可能と考えられる。