Research Abstract
GONAD：Genome-editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery system：核酸の卵管内注入、続く生体内電気穿孔法による顕微注入法を用いない新しいゲノム操作法
GONAD: Genome-editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery system: a novel microinjection independent genome engineering method in mice
2015年6月22日 Scientific Reports 5 : 11406 doi: 10.1038/srep11406
顕微注入法は、受精卵ゲノムに核酸（遺伝子あるいはCRISPR/Cas9系などのゲノム編集ツール）を導入する遺伝子改変動物作製のための代表的技術である。顕微注入法を実行するには、マイクロマニピュレーターなどの高価な設備や熟練した高度な技術が必要である。今回我々は、GONAD（Genome-editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery）と呼ばれる、顕微注入法を用いない新規かつ簡便な手法を開発した。GONADを用いて、妊娠マウス卵管内に核酸（例えば、eGFP mRNAあるいはCas9 mRNA/sgRNA）を注入し、直ちに卵管全体に電気穿孔を付すことにより、卵管に存在する着床前胚（2細胞期）に効率的に遺伝子導入できること、また、その結果、胚ゲノム内の目的遺伝子に変異を導入できることが分かった。したがって、GONADにより一般的なトランスジェニックマウス作製に必要とされる「受精卵の単離、受精卵への核酸の顕微注入、および核酸注入胚の偽妊娠マウスへの移植」などの煩雑な作業が回避できる。さらに、この方法はマウス以外の動物種（例えば、ブタやウシ）におけるゲノム編集にも適用できる可能性がある。
Gou Takahashi, Channabasavaiah B Gurumurthy, Kenta Wada, Hiromi Miura, Masahiro Sato & Masato Ohtsuka
Corresponding Authors
Microinjection is considered the gold standard technique for delivery of nucleic acids (NAs; transgenes or genome editing tools such as CRISPR/Cas9 systems) into embryos, for creating genetically modified organisms. It requires sophisticated equipment as wel as well-trained and highly skilled personnel to perform the micro-injection technique. Here, we describe a novel and simple microinjection-independent technique, called Genome-editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery (GONAD). Using GONAD, we show that NAs (e.g., eGFP mRNA or Cas9 mRNA/sgRNAs) can be effectively delivered to pre-implantation embryos within the intact mouse oviduct by a simple electroporation method, and result in the desired genetic modification in the embryos. Thus GONAD can bypass many complex steps in transgenic technology such as isolation of zygotes, microinjection of NAs into them, and their subsequent transfer to pseudo-pregnant animals. Furthermore, this method can potentially be used for genome editing in species other than mice.
