2012年、英国ロンドンがん研究所のCharles Swantonは、がんの最も「いやらしい」性質の1つに直面して暗たんたる気持ちになった。それは、彼の研究チームが数個の腎腫瘍から採取したDNAの塩基配列を解読したときのことであった。当初の予想は、さまざまに異なる変異が多数見つかるだろうという程度のものだった。ところが、1個の腫瘍でも、その内部には幅広い遺伝的多様性が存在していることが分かり、Swantonらはこの結果に衝撃を受けた。1個の腫瘍の端から採取した細胞と別の端から採取した細胞で変異に差異があり、腫瘍の塊全体に共通する変異の数は全変異のわずか3分の1にすぎなかったのだ。腫瘍細胞が患者体内の他の部位に拡散・定着してできた二次腫瘍（いわゆる転移がん）でも変異に差異があった¹。

これらの結果から、がんの標準的な診断手順である「生体組織診断」（生検；病変組織の一部を採取して顕微鏡で調べる検査）がかなり不十分な検査法であることが確実となった。街の1つの通りだけを調べて国民のふるまいを把握しようとするようなものだからだ。1回の生検だけでは数cm離れた箇所に存在する変異を見逃してしまうかもしれず、そうなれば患者の生存確率は大きく変わってしまう可能性がある。また、生検では、腫瘍の分子標的療法の標的となる特定の変異についてのデータが得られるものの、そうした情報は検査時の一瞬を切り取った静的なものであり、がんが「進化」するにつれて正しい情報ではなくなっていく。

Swantonのチームが暴き出した腫瘍内の多様性は、対処できるとは到底思えないものだった。「正直なところ、私は今もまだこの事実に打ちのめされています。そして、あのとき分解能のもっと高い分析を行っていたら、この程度の困惑では済まなかったでしょう」と彼は話す。

しかし、1人の患者のがんについて詳しい情報を得るだけでなく、そのがんを経時的に追跡することもできる方法がすでに見つかっている。がん細胞は、破裂して死ぬときに内容物を放出するが、そこにはゲノムのDNA断片も含まれている。これらのDNA断片が血流に乗ったものは、「循環血中腫瘍DNA（ctDNA）」と呼ばれる。正常細胞が死ぬと、その破片は普通、マクロファージなどの「掃除屋」細胞によって片付けられるが、腫瘍は大きくて腫瘍細胞の増殖も速いので、そうした掃除屋では完全に処理できないのである。

血流中の腫瘍DNAの量を測定したり塩基配列を解読したりする方法の開発・改良によって、採血が「液体生検」になりつつある。これによって、従来の生検などで得られる「鍵穴から見える部分だけの姿」でなく、包括的ながんの全体像に迫ることができる。例えば、経時的に採血することで、治療が効いているか、また、腫瘍が薬剤耐性を進化させているかどうかを知ることができるのだ。

ご多分に漏れず、この方法にも注意すべき点がある。ctDNA量は個人差が大きく、また検出が難しい場合もあり、早期の小さい腫瘍の場合は特に検出が困難だ。さらに、これまでの研究の多くは、少数かせいぜい数十人の患者しか対象にしておらず、腫瘍の型も数種類にすぎない。それらの研究結果は期待できるものだったが、もっと大規模な研究で正当性を確認する必要がある。そうした研究によって、ctDNAから本当に正確な情報が得られるのかどうか、もっと重要なことを言えば、ctDNAによって患者の命が救えたり延命できたりするのかどうかが明らかになるはずだ。「腫瘍を監視するというだけでは不十分なのです。我々が直面している難題は、ctDNAの真の有用性を見いだすことなのです」とジョンズホプキンス大学（米国メリーランド州ボルティモア）のがん専門医Luis Diazは言う。

これらのハードルがクリアできれば、より良い治療法の選択や、病状の変化に応じた治療法の変更に液体生検が役立つだろう。ジョンズホプキンス大学の遺伝腫瘍学者Victor Velculescuはそう話す。さらに、ctDNAの研究から新しい治療標的も見つかるかもしれない。「ctDNAは個別化医療の実現に役立つでしょう。医療のあり方を変えるほどの存在になります」とVelculescu。

遅れてきた検査法

ヒトの血中をDNAが循環していることが初めて報告されたのは、1948年のことである²。その後、1977年になって、がん患者の循環血中のDNA量に関する研究結果が報告された³。がん患者の循環血中DNAに、がんに特徴的な変異（つまり腫瘍由来のDNAという証拠）があると分かったのは、それからさらに17年後の1994年のことである^4,5。

循環血中DNAが最初に活用されたのは、がん以外の分野だった。現在は香港中文大学（中国）にいる化学病理学者Dennis Loが、腫瘍から血液へDNAが放出されているのなら胎児でもきっと同じだろうと考えたのだ。彼は1997年に、妊娠中で胎児が男の子であることが分かっていた女性の血中に、Y染色体由来、つまり胎児由来のDNAが存在することを示した⁶。この発見によって、妊娠初期に胎児に害を及ぼすことなく性別を判定することが可能になった。また、さらにその後、ダウン症候群などの発達障害を、侵襲的な検査に頼らずにスクリーニングすることも可能となり、出生前診断の分野に変革をもたらした（Nature 2014年3月6日号19ページ参照）。

「がんへの応用は出遅れてしまいました」と英国ケンブリッジがん研究所のゲノミクス研究者Nitzan Rosenfeldは言う。その一因は、腫瘍DNAの検出が胎児DNAに比べてはるかに難しい点にある。通常、血中の腫瘍DNA量は少なく、変動も大きい。かなり進行したがんの患者では、循環血中DNAの大部分の供給源が腫瘍だと考えられるが、普通、ctDNAは循環血中DNAのせいぜい1％で、0.01％程度しかない可能性もある。初期の頃の塩基配列解読技術には、これを検出できるほどの精度がなく、ctDNAを高い信頼度でバイオマーカーとして常に使うことはどう見ても無理だった。

しかし、ここ十年ほどの間に、微量DNAの検出や定量ができる高感度の技術が次々と登場した。例えば「BEAMing」という、循環血中DNAの1分子を1個の磁気ビーズ上に固定し、フローサイトメトリーを用いて定量する変異解析法を使えば、たとえ健康な細胞由来のDNAがctDNAの1万倍あったとしてもctDNAを検出することができる。

この手法を開発したのは、ジョンズホプキンス大学の遺伝腫瘍学者Bert VogelsteinとKenneth Kinzlerだ。彼らは2007年の論文⁷で、大腸がんの治療を受けている患者18人にこの手法を使ってctDNAを追跡したことを報告した。これらの患者のctDNA量は手術後に99％減少したが、多くの場合、完全には消失しなかった。術後の経過観察のための最初の外来診察でctDNAが検出可能な量だった患者のうち、1人を除く全員が最終的に腫瘍を再発した。一方、術後のctDNAが検出不能な量だった患者では1人も再発しなかった。

これらの結果から、ctDNAを利用して、その患者に手術がどれくらい有効か、また、なかなか消えないがん細胞を消し去るために化学療法が必要かどうかを見極められると考えられた。Rosenfeldは、英国ケンブリッジがん研究所の同僚のJames BrentonやCarlos Caldasとともに、進行した卵巣がんや乳がんの正確な情報をctDNAから得られることを示した⁸。またジョンズホプキンス大学のDiazのチームは、これまでで最大規模の研究を行い、進行した腫瘍（膵臓、膀胱、皮膚、胃、食道、肝臓、頭部および頸部という多様な臓器の腫瘍）を持つ患者の少なくとも75％でctDNAを検出した⁹（ただし、脳のがんは例外で、ほとんど検出されなかった。これは、血液脳関門があるために腫瘍DNAが血流へ入らないためだと考えられる）。

より優れたバイオマーカー

研究者らはこの数十年にわたって「タンパク質」バイオマーカーを探し求め、あるいは改良してきたが、循環血中DNAはそれより優れたマーカーになるかもしれない。タンパク質バイオマーカーは現在、診療現場で疾病の診断や治療中の患者の経過観察に使われている。例えば、前立腺がんのバイオマーカーは前立腺がんに特異的な抗原を用いているが、がん以外の理由でもその抗原の血中値が上昇することがあり、偽陽性になる場合がある。それに対し、ctDNA法ではがん細胞の特徴である変異や他のゲノム変化をもとに判定するため、偽陽性はもっと少なくなると考えられる。また、多くのタンパク質バイオマーカーは血中に数週間とどまるが、ctDNAは半減期が2時間未満と短く、そのため腫瘍の過去ではなく現在の様子がはっきり捉えられる。ケンブリッジ大学とジョンズホプキンス大学の各チームはそれぞれ、乳がん¹⁰および大腸がん⁹に関して、ctDNAの方がタンパク質バイオマーカーより高感度であり、腫瘍の消失や拡散、再発をより正確に追跡できることを明らかにした。

また、どちらの大学のチームも、循環血中の腫瘍細胞よりもctDNAの方がマーカーとして高精度であることを見つけた。循環血中腫瘍細胞（CTC；Circulating Tumor Cell）とは、ctDNAと同様に血流に乗って体内を循環する遊離がん細胞のことで、がん研究のテーマの1つとなっている。Diazのチームは患者16人に関する予備調査で、血中にctDNAと腫瘍細胞の両方が存在している場合、ctDNAはCTCに比べて50倍も存在することを明らかにした⁹。また、CTCがあればctDNAも常に存在していたが、検出可能なctDNAが存在してもCTCが見当たらない患者が13人いた。

しかし、研究者にとって最もうれしいのは、腫瘍が時間とともに進化し適応していく過程を捉えられることだとDiazは言う。「ctDNAは、これまで答えが得られなかった腫瘍学上の疑問を解く助けとなるでしょう」。

そうした例の1つが、なぜこれほど多くの分子標的療法が失敗に終わっているのか、という疑問だ。上皮細胞増殖因子受容体（EGFR）は細胞増殖や細胞分裂に関わるタンパク質で、多くのがんで過剰に活性化している。このEGFRの阻害剤として、ゲフィチニブやパニツムマブなどの分子標的薬がある。患者がこれらの薬剤を服用すると、当初は非常に効き目があるが、数カ月もすると患者のがんは十中八九、耐性を獲得する。この耐性獲得には多くの場合、さまざまながんで変異しているKRASなどの他の遺伝子の変化が関わっている。

患者の経過観察と今後の治療法を検討するには、複数の生検を行うのが一般的である。しかし、進行がんの患者には多くの場合、検査すべき腫瘍が数個あり、その全ての腫瘍が部分ごとに異なる経緯を経て耐性を獲得していると考えられる。生検は侵襲的で、リスクもあり、肺などの検査機器が届きにくく破損しやすい臓器では難しい。「失敗した後、患者さんに生検をもう5回やりますとはさすがに言えません」とVelculescuは話す。それに比べれば採血ははるかに簡単だ。

Diazのチームは、EGFR阻害剤を投与されている患者のctDNAを調べ、その結果を2012年に発表した¹¹。ctDNAからは、がんに耐性を獲得させるKRAS変異が42種類見つかった。これらが見つかった時期は、画像化法によって腫瘍が進行中だと判明した時期より、平均して5カ月も前だった。DiazのチームはKRAS変異を特異的に調べてこれらの変異を発見したが、Rosenfeldのチームは完全に手探りの状態からctDNAを利用して耐性獲得変異を突き止めた。2013年にRosenfeldのチームは、進行した乳がん、肺がんや卵巣がんの患者計6人から採取した血液試料中の全エキソーム（ゲノムのうちタンパク質をコードする1％の領域）の塩基配列解読と解析結果を報告した¹²。5人の患者では、Rosenfeldらの焦点を絞らない方法によって耐性獲得への複数ルートが明らかになり、その中には薬剤が標的タンパク質に結合できなくなる変異も含まれていた。

早い段階で薬剤耐性が分かれば、体に害があって高価で、しかも効き目の持続する可能性が低い薬剤を患者に投与しなくて済む。また、耐性の原因となっている変異を突き止めれば、有効な代替薬や薬剤併用法を見つけることもできる。「がんが、死の病ではなく、持病の1つとして扱えるようになってほしいですね。受けている治療の効き目がなくなったら、効果のある別の治療法に切り替えるわけです」とVelculescuは話す。

臨床応用へのハードル

ctDNAは、期待されてはいるものの、臨床で主役を務められる段階にはまだない。問題の1つは、ctDNAを最も高感度で検出できるBEAMingなどの手法だと、探すべき変異についてある程度の情報が事前に必要になることだ。つまり、生検を行って変異の塩基配列を明らかにした上で、その配列を標的にする患者特異的な分子プローブを設計し、それを使って血液試料を分析するという手順が事前に必要になる。この面倒な手順を、患者1人1人について繰り返さねばならない。これに代わる方法は、Rosenfeldのチームが行ったようなエキソーム塩基配列解読の利用だ。この方法には、対象のがんに関する事前情報は必要ないが、希少な変異DNA断片を検出できる読み取り深度（分解能）で全ての試料の配列を解読して解析することが必要で、とんでもない費用がかかる。

そこで、スタンフォード大学（米国カリフォルニア州）の放射線がん科医Maximilian Diehnは、上記2つの方法のいいところを組み合わせることにした。その結果、肺がんで頻繁に変異する、ゲノムのわずか0.004％でしかない小領域を突き止めることに成功した¹³。研究チームは新しい血液試料を入手するたびに、この小領域の配列解読を1万回繰り返している。こうすることで、ごく少数の変異DNA断片でも拾い出すことができ、焦点を絞ることで費用も低く抑えられる。肺がん患者のほぼ全員がこのゲノム領域に1個以上の変異を持っているため、この検査法はほぼ全ての患者に有効だろうとDiehnは言う。彼のチームは現在、他の複数種類のがんについても同じような変異を拾い出そうと研究中だ。また、臨床試験でもこの検査法の正当性を確認する予定であるが、それには数年かかる見込みだ。

Diehnの開発したこの検査法は、早期がんの検出という点ではあまり有効でなく、その点は実質的に全てのctDNA生検法と同様である。この方法を使った小規模な研究¹³では、ステージIIかそれ以降のステージの肺がんが全て検出できたが、ステージIだと半数しか検出できなかった。この結果は、進行したがんがより多くのDNAを放出するとすれば理解できるが、がんスクリーニング用のツールとしてのctDNAの可能性は狭まる。

Diehnは、もっと高感度の検査法があればこの問題を克服できると話すが、Diazの考えは異なる。「ctDNAの可能性を制限しているのは生物学的な特性そのものです。そもそも血流中にはDNA断片があまり存在しないのです」と彼は言う。それに、もしctDNA検査でこれまで未検出だったがんの存在を察知した場合、どうすればいいのだろうか。「たとえ血中DNAに変異を見つけても、それがどこから来たのかは分かりません」とDiazは指摘する。

分からないことは他にもある。ctDNAから得られる情報は本当に元のがんに対応しているのだろうか。他の臓器に転移した腫瘍は元の腫瘍と同じくらいの量のDNAを放出するのだろうか。また、1個の腫瘍内の全ての細胞がそれぞれ同じ量のctDNAを放出するのだろうか。これらの疑問を解くには、「死後の迅速な剖検（warm autopsy）」を行うしかないとDiazは言う。つまり、患者の死後すぐに腫瘍の全てから試料採取して特徴を解析し、それらを、生存中に採ったctDNAと比較するという方法だ。「これは大仕事ですが、ctDNA研究の発展のために行う必要があるでしょう」と彼は話す。

そして最も重要な疑問がまだ残っている。腫瘍量の正確な把握や、次々と生じる変異のリアルタイム検出が、果たして本当に患者を救い、生活の質を向上させることにつながるのか、という疑問だ。患者の腫瘍に耐性獲得変異が1個生じていることが分かっても、その変異の分子標的薬がなければ、見つけた情報は役に立たないことになる。「この限界が分子標的療法の現状なのです。体内にある腫瘍に関する情報を全て得られたからといって、それでどうなりますか。がんを解明するための取り組みばかりが大きく進み、現行の治療の選択肢では得られた情報に対応しきれないのです」とVelculescuは語る。

現状では、ctDNAが臨床でがんの転帰を左右することはまだない。だが、研究用ツールとしては極めて有用だと考えられるため、ctDNAの日常的な収集が始まっている。例えばSwantonは、 「TRACERx」（Tracking Cancer Evolution Through Therapy；治療によるがん進化の追跡）と呼ばれる1400万ポンド（約24億円）の肺がん研究を主導している。これは、従来の生検法と3カ月に1度の採血によるctDNA検査法を併用する予定だ。循環血中DNAから、被験者にとって有益な手掛かりが得られるかどうかは分からない。しかし、これによって少なくともSwantonは、肺がんの進化の仕方やその進化を制御する方法をさらに解明できるだろう。

Rosenfeldが言うように、ctDNAの情報は、ないよりはあった方がいい。彼は現時点でこう述べている。「我々は今、暗闇を手探りで進んでいます。何が起こっているかを少しでも見ることのできる方法があるなら、それを使わない手はないでしょう」。

翻訳：船田晶子