Articles

尿酸の腎外排泄の低下は高尿酸血症の一般的な原因である OPEN

Decreased extra-renal urate excretion is a common cause of hyperuricemia

Nat. Commun. 3 : 764 doi: 10.1038/ncomms1756 (2012)

市田 公美1,2,12, 松尾 洋孝3,12, 高田 龍平4,12, 中山 昌喜3,5, 村上 啓造4, 清水 徹6, 山梨 義英4, 春日 裕志4, 中島 宏7, 中村 好宏8,9, 高田 雄三10, 河村 優輔3, 井上 寛規3, 岡田 千沙3, 内海 由貴3, 池淵 祐樹4, 伊藤 晃成4, 中村 真希子1, 篠原 佳彦1, 細山田 真11, 櫻井 裕7, 四ノ宮 成祥3, 細谷 龍男2 & 鈴木 洋史4

  1. 東京薬科大学 病態生理学教室
  2. 東京慈恵会医科大学 腎臓・高血圧内科
  3. 防衛医科大学校 分子生体制御学講座
  4. 東京大学医学部附属病院 薬剤部
  5. 航空自衛隊 航空医学実験隊 第3部
  6. みどりヶ丘病院(大阪府高槻市)
  7. 防衛医科大学校 衛生学公衆衛生学講座
  8. 防衛医科大学校 数学研究室
  9. 理化学研究所 ゲノム医科学研究センター 統計解析グループ
  10. 防衛医科大学校 共同利用研究施設
  11. 帝京大学 薬学部人体機能形態学研究室
    本研究は、市田公美、松尾洋孝、高田龍平の3研究者が同等に貢献した成果として論文発表しています。

Abstract

ABCG2(別名BCRP)は高容量性の尿酸排泄輸送体で、その機能低下は痛風や高尿酸血症のリスクを上昇させる。高尿酸血症は一般に、尿酸の「産生過剰型」、あるいは「排泄低下型」に分類されるが、これは腎臓からの尿酸排泄のみに基づいており、腎外排泄経路については考慮されていなかった。本論文では、ABCG2の機能低下によって起こる腎外尿酸排泄の低下が、高尿酸血症を引き起こす一般的な機構であることを示した。高尿酸血症の男性644人の外来患者において、尿への尿酸排泄などの臨床データを調べたところ、一見矛盾しているように見えるが、ABCG2の排泄機能低下は、尿への尿酸排泄量を増加させ、尿酸過剰産生のリスク比を有意に上昇させた。Abcg2ノックアウトマウスでは、血清尿酸値上昇および腎臓からの尿酸排泄量増加と、腸管からの尿酸排泄量の低下が見られた。腎外組織でのABCG2発現レベルが高いことと考え合わせると、我々のデータは、従来の概念における高尿酸血症の「尿酸産生過剰型」は、「腎外排泄低下型」と真の「尿酸産生過剰型」の2つのサブタイプからなる「腎負荷型」と命名し直すべきであることを示唆している。今回の結果は、高尿酸血症および痛風の治療に有用な新しい概念をもたらすであろう。

Introduction

高尿酸血症は、痛風や腎臓結石を引き起こし、腎臓や心臓血管系疾患の進行を速める1,2。ほかの哺乳類とは異なり、ヒトをはじめとするヒト上科の動物は、高い血清尿酸値(SUA)を示す。というのも、これらの動物種では尿酸分解酵素であるウリカーゼが失われているため、尿酸がプリン代謝の最終産物となるからである3。一般的には、尿酸の3分の2は腎臓からの「腎排泄経路」を通って尿中へ排泄され、残りの3分の1は腸管排泄のような「腎外排泄経路」を通ると考えられている4,5。臨床的に高尿酸血症は、尿酸の「産生過剰型」「排泄低下型」そして「混合型」に分類されている6-9。しかし、この分類は腎臓での尿酸排泄量と尿酸クリアランスのみに基づいており、例えば腸管排泄経路のような腎外排泄については考慮されていない。

SUAの制御は、主に腎臓によって行われていると考えられており、腎臓での尿酸排泄は、尿酸の再吸収と分泌のバランスによって決まる。腎臓の尿酸再吸収は、主に2つの尿酸トランスポーター、urate transporter 1(URAT1、別名SLC22A12)10とglucose transporter 9(GLUT9、別名SLC2A9(refs 11-15))を介して行われる。近年のSUAにおけるゲノムワイド関連解析から、ATP-binding cassette transporter, sub-family G, member2(ABCG2、別名BCRP16-18)などの、複数のトランスポーター遺伝子の関与が明らかにされた。以前に行われた痛風のゲノムワイド連鎖解析により、第4染色体長腕に痛風の感受性遺伝子座が同定されているが19ABCG2遺伝子はそこに位置している。Woodwardたちと我々のグループは、それぞれ別々に、ABCG2が尿酸輸送を行うことを見いだし、機能半減型変異Q141K(rs2231142)により尿酸輸送が減少することを示した20,21。それに加えて、ABCG2が、腎臓や腎外での尿酸排泄を調整する高容量性の尿酸排泄輸送体であることも明らかにした21。また我々は、ABCG2遺伝子において機能低下をきたす、頻度の高い遺伝子型の組み合わせ(Q126X(rs72552713)とQ141K)が、痛風の主要な病因であることも示している21

本研究では、高尿酸血症の患者とマウスモデルにおいて、ABCG2の機能低下と尿酸排泄の関係について調べた。その結果、尿酸の腎外排泄の減少が、高尿酸血症の一般的な原因であることが明らかになった。これは高尿酸血症に対する従来の病態生理の概念においては、考慮されてこなかったものである。

Results

高尿酸血症患者における腎臓からの尿酸排泄

Figure 1 | 従来の高尿酸血症の分類
Figure 1 | 従来の高尿酸血症の分類 | 拡大する

高尿酸血症の分類は、UUEと尿酸分画排泄率(FEUA)に基づいて行われる。本研究では、UUEが25.0 mg h−1/1.73 m2(一日当たり600 mg/1.73 m2)より大きいときに、患者を産生過剰による高尿酸血症と分類した。また、FEUAが5.5%未満のとき、排泄低下型高尿酸血症に分類した。UUEとFEUAが両方とも産生過剰と排泄低下の高尿酸血症の基準に当てはまるとき、混合型に分類した。産生過剰による高尿酸血症の基準のみに合うが、混合型には含まれない患者を、産生過剰型と定義した。この図で示した病型に加えて、UUEが ≤ 25 mg h−1/1.73 m2かつFEUA ≥ 5.5%の場合が「正常型」である。UUEの単位はmg h−1/1.73 m2である。

本研究では、高尿酸血症患者でのABCG2の機能低下と腎臓における尿酸排泄との関係を調べた。被検者の特性と遺伝子型は、それぞれ Supplementary Table S1S2 に概要を示した。患者の高尿酸血症の分類は、高尿酸血症の病型分類に従って決定した(Fig. 1)。これは、患者の尿中尿酸排泄量(urinary urate excretion, UUE)と、尿酸クリアランスの分画排泄率(urate clearance/creatinine clearance ratio, FEUA)に基づいている。575例の痛風を含む644人の高尿酸血症の男性外来患者では、Q126X(リスクアレルX)とQ141K(リスクアレルK)のリスクアレル頻度は、それぞれ4.1%と45.9%であった。Q126XとQ141K変異を持つ人の割合は、すべての患者のうち、それぞれ8.1%と71.9%であった(Supplementary Table S2)。続いて、ハプロタイプ頻度解析では、Q126XとQ141Kのマイナーアレルが、異なるハプロタイプ上に認められ(Supplementary Table S3)、以前報告されたように21、これらの変異は独立したリスクであることが示された。以上のことから、2つの頻度の高い遺伝子型である機能欠失型のQ126Xと機能半減型のQ141K(Supplementary Fig. S1)の組み合わせにより、ABCG2の尿酸排泄機能を推定できた。そこで、遺伝子で推定されるABCG2機能から、患者を完全機能型、3/4機能型(軽度の機能低下)、1/2機能型(中程度の機能低下)、および ≤ 1/4機能型(重度の機能低下)の4つのグループに分類した(Supplementary Table S4)。合計すると、すべての患者のうち75.6%でABCG2に機能低下が認められた。

Figure 2 | | ABCG2機能低下によるUUEの増加と産生過剰による高尿酸血症の頻度
Figure 2 | ABCG2機能低下によるUUEの増加と産生過剰による高尿酸血症の頻度 | 拡大する

(a) ABCG2の機能ごとのUUE(n = 644)。高尿酸血症の患者は、推定されるABCG2機能から、完全機能型、3/4機能型、1/2機能型、≤ 1/4機能型の4つのグループに分けられる。UUEはABCG2機能と逆相関を示した(単純線形回帰解析よりP = 3.60×10−10)。バーはすべて平均 ± 標準誤差を示す。(b) ABCG2の機能ごとの「産生過剰」による高尿酸血症の頻度。「産生過剰」による高尿酸血症は、産生過剰型と混合型からなる。

Figure 2aは、ABCG2機能とUUEの関連性を示している。ABCG2の機能低下が腎臓での尿酸排泄減少につながるとする一般的な理解に反して、UUEはABCG2の機能低下に伴い顕著な増加を示した(P = 3.60×10−10)。ABCG2機能が完全である患者の平均UUEレベルは、24.0 mg h−1/1.73 m2であり、強い機能低下(≤ 1/4機能)の患者では、34.3 mg h−1/1.73 m2と、42.9%増加していた。産生過剰型と混合型を含めた「産生過剰」による高尿酸血症(UUE > 25 mg h−1/1.73 m2)(Fig. 1)は、その頻度もABCG2の機能低下により増加する。「産生過剰」による高尿酸血症の割合は完全機能型の患者の38.2%であったが、重度の機能低下型では89.7%に達した(Fig. 2b)。特に重度のABCG2の機能低下では、「産生過剰」による高尿酸血症のリスクが増加しており、リスク比(RR)は2.35(95% CI 1.86–2.97; P = 3.32×10−7)を示した(Table 1)。さらに、中程度と軽度の機能低下でも、「産生過剰」による高尿酸血症のリスクの有意な増加が見られ、それぞれRRが1.66(95% CI 1.32–2.10; P = 8.58×10−6)と1.36(95% CI 1.09–1.71; P = 4.55×10−3)であった。「産生過剰」による高尿酸血症のリスクは、補正を行った後も有意であった(Table 1)。これらの結果は、ABCG2の機能低下がUUEを増加させ、その結果、「産生過剰」による高尿酸血症の頻度が増加することを明確に示している。このことは高尿酸血症の従来の考え方に照らすと矛盾しているようであるが、尿酸制御においてABCG2による腎外排泄が生理学的に重要であるとすれば、理解できる結果である。

Estimated transport activity Genotype N Frequency of OP hyper-uricemia RR 95% CI P Adjusted RR Adjusted 95% CI Adjusted P
Q126X (rs72552713) Q141K (rs2231142) OP hyper-uricemia* Non-OP hyper-uricemia*
≤1/4 Function X/X Q/Q 26 3 0.897 2.35 1.86–2.97 3.32×10−7 2.30 1.31–3.90 2.65×10−3
Q/X Q/K
1/2 Function Q/X Q/Q 96 55 0.636 1.66 1.32–2.10 8.58×10−6 1.79 1.25–2.59 1.55×10−3
Q/Q K/K
3/4 Function Q/Q Q/K 160 147 0.521 1.36 1.09–1.71 4.55×10−3 1.42 1.03–2.00 0.035
Full function Q/Q Q/Q 60 97 0.382 1.00

Table 1 | 産生過剰による高尿酸血症とABCG2機能低下の関係

略号: CI 信頼区間; OP 産生過剰; RR リスク率
*患者はUUEが25.0 mg h−1/1.73 m2(一日当たり600 mg/1.73 m2)のとき、産生過剰による高尿酸血症(産生過剰型と混合型)と分類した。UUEは体表面積1.73 m2で標準化した。そのほかの患者は、非産生過剰高尿酸血症に分類した。
RRと95% CIおよびP値は、ポアソン回帰分析により、body mass index (BMI)、アルコール摂取、尿酸関連遺伝子の一塩基多型(URAT1のrs506338、GLUT9のrs11722228、PDZK1のrs12129861)の共変数を用いて補正した。

マウスにおけるAbcg2機能低下と尿酸排泄

Figure 3 | マウスモデルにおけるAbcg2を介した尿酸排泄
Figure 3 | マウスモデルにおけるAbcg2を介した尿酸排泄 | 拡大する

(a)Abcg2を介した濃度依存的尿酸輸送(n = 3)。(b)Abcg2を介した尿酸輸送に対するオキソン酸の影響(n = 3)。(c– e, g, h)Abcg2ノックアウトと野生型マウスを用いたin vivo解析。(c)血清中尿酸(SUA)値(n = 19–20)。***P = 8.8×10−6。(d)尿酸の尿中排泄(n = 10–11)。 ***P = 4.1×10−4。(e)腸管尿酸排泄の経時変化(n = 4)。***P < 0.001; **P = 0.0066; *P = 0.021。経腸管尿酸輸送(n = 3–4)。*P = 0.037(20分)、*P = 0.034(30分)。(g)腸管と胆汁への尿酸排泄(n = 3–4)。 ***P = 3.6 ×10−4。バーはすべて平均 ± 標準誤差を示す。P値はStudent t-検定により求めた。NS, 有意差なし。(h)尿、腸管、胆汁からの尿酸排泄経路の相対的な寄与率。

次に我々は、ABCG2の機能低下がどのようにして尿酸排泄経路に影響するのかについて調べ、ABCG2機能低下に基づいて、高尿酸血症に対する従来の概念を見直した。腸管内腔に排泄される尿酸は、細菌叢によって速やかに代謝されるため、ヒトで腸管からの尿酸排泄を評価することは、本質的に難しい。この問題を解決するために、我々は腸管を介した尿酸排泄の侵襲的サンプリングが容易に行える動物モデルを導入した。また、このモデルで、尿酸分解酵素ウリカーゼを欠くヒトの尿酸代謝と同じようにするために、Abcg2ノックアウトマウスに対してウリカーゼ阻害剤であるオキソン酸処理を行った22。まず、 マウスのAbcg2を発現させたHEK293細胞から調製した細胞膜小胞を用いて、マウスのAbcg2が尿酸を輸送することが示された(Fig. 3a)。マウスAbcg2による排泄過程はATP依存的で、尿酸の生理的濃度条件下では飽和しなかった(Fig. 3a)。このことはAbcg2の高容量性の尿酸輸送能を示している。また別の機能解析で、オキソン酸がAbcg2による尿酸輸送に影響を与えないことが示された(Fig. 3b)。次に、我々はこのin vivoマウスモデルを用いて、尿や胆汁、腸管腔への尿酸排泄の検討を試みた。Fig. 3cに示すように、Abcg2ノックアウトマウスのSUAは、 対照群のマウスのSUAよりも有意に高かった(P = 8.8×10−6)。これはABCG2の機能低下したヒトにおいて、SUAの上昇が見られることと一致する21。この条件下では、尿中の尿酸/クレアチニン比は、Abcg2ノックアウトマウスで有意に上昇しており(P = 4.1×10−4)(Fig. 3d)、これもヒトでの所見を裏付けるものである(Fig. 2a)。他方で、Abcg2ノックアウトマウスでの腸管からの尿酸排泄は有意に低く(Fig. 3e)、この傾向は経腸管尿酸輸送実験においても同様であった(Fig. 3f, Supplementary Fig. S2)。Abcg2ノックアウトマウスで算出された腸管尿酸排泄速度は、対照群マウスの半分以下であり(P = 3.6×10−4)(Fig. 3g)、一方で胆汁尿酸排泄ではAbcg2の遺伝子型による違いは見られなかった(Fig. 3g)。これらの結果から、それぞれの経路の総尿酸排泄への相対的な寄与率を見積もった。野生型マウスでは、UUE経路の寄与は約3分の2にあたり、腸管排泄経路は全体の尿酸排泄のうち3分の1に相当した。また胆汁への尿酸排泄は総尿酸排泄の2.2%であった(Fig. 3h)。それぞれの尿酸排泄経路の割合は、これまでのヒトの尿酸排泄経路の概算についての報告と一致するものであった4,5Abcg2ノックアウトマウスでの尿酸排泄は、腸管排泄が低下した結果として尿中排泄経路への依存度がより高くなる(Fig. 3h)。さらに、マウスでの胆汁尿酸排泄の寄与が少ないことも(Fig. 3h)、ヒトでの尿酸排泄で胆汁尿酸排泄が、総尿酸排泄の5%に満たないとする報告と一致する23。以上のことから、ABCG2は腎外尿酸排泄、特に腸管からの尿酸排泄に重要な役割を持つことが示唆された。したがって、ABCG2機能の低下した患者でのSUA上昇は、腸管からの尿酸排泄の低下により説明可能である。

Discussion

本研究では、高尿酸血症患者における尿酸トランスポーターABCG2の機能低下が、UUEの増加や、産生過剰型と混合型からなる産生過剰による高尿酸血症の頻度と関連することを見いだした。また、頻度の高い機能低下型変異によるABCG2機能低下は、いずれも産生過剰による高尿酸血症のリスクを有意に増加させた。Abcg2ノックアウトマウスをオキソン酸で処理すると、 同様の処理をした野生型マウスと比較して、腎臓での尿酸排泄増加に加えてSUAが上昇し、腸管での尿酸排泄が低下した。以上のことから、機能低下型ABCG2による腎外尿酸排泄の低下は、高尿酸血症を発症する一般的なメカニズムであり、UUE上昇が尿酸の「産生過剰」に起因すると考えられていた、これまでの理解が間違っていることを示している。

ヒトでSUAを制御するトランスポーターは、主要なものが3つ確認されている。尿酸分泌トランスポーターABCG2と、尿酸再吸収トランスポーターURAT1(ref. 10)およびGLUT9(refs 14,15)である。さらに、ABCG2とURAT1をはじめとする尿酸トランスポーターは、PDZドメインを含むアダプタータンパク質PDZK1により制御される(refs 24,25)。これらの尿酸関連遺伝子のうち、ABCG2の機能低下型変異は、痛風と高尿酸血症の主要因であることが示されている20,21。ABCG2は腎臓26や肝臓、腸管27をはじめとする、いくつかの組織の管腔側で発現している。ABCG2は腎臓での尿酸排泄を調整すると考えられていたことから20、この分子の機能低下はUUEの減少につながると予測された。しかし本研究では、ABCG2の機能低下はUUEの増加を引き起こすという、逆の結果を示した。この矛盾は、次の2つの事実により説明しうる。すなわち、腎臓はABCG2を発現する唯一の臓器ではないということ27,28、そしてヒトでの尿酸排泄の1/3は、腸管排泄などの腎外経路に依存することである4,5,8。また、URAT1の腸管での発現がほとんどないことを合わせて考えると(ref. 10)、今回、Abcg2ノックアウトマウスで認められた腎臓でのUrat1の発現低下という結果は、尿中尿酸排泄増加の部分的な原因である可能性を示している(Fig. 3d, Supplementary Fig. S3)。これらのことから、一般的なABCG2の機能低下は、腎臓経路よりもむしろ腎外経路を介して、尿酸排泄の低下を引き起こしていると考えられる。

Figure 4 | 各種における地理的距離と遺伝的距離の関係
Figure 4 | 各種における地理的距離と遺伝的距離の関係 | 拡大する

高尿酸血症はこれまで尿酸の「産生過剰型」(A)と「排泄低下型」(B)、混合型に分類されてきた。腎外尿酸排泄も考慮に入れることで、「産生過剰型」は「腎負荷型」(A)に改名すべきであり、これは2つのサブタイプ、真の「産生過剰」(A1)と、「腎外排泄低下型」(A2)からなっているとするテストモデルを提唱する。

従来の高尿酸血症の分類は、その発症機序に対する理解に基づいており、そこでは高尿酸血症は代謝異常による尿酸の産生過剰、腎臓尿酸輸送能の異常による排泄低下、あるいはその2つが組み合わさった結果として生じるとしている。これまで「腎臓における尿酸排泄低下」は高尿酸血症の主要因であると広く考えられており、「尿酸産生過剰」はもう1つの主要因であると考えられてきた。高尿酸血症の一部は、明らかに過度のアルコールや高カロリー食の摂取といった生活習慣要因に起因する。しかし、そのような要因を加味しても、「産生過剰」による高尿酸血症の原因の多くは説明できない。「産生過剰」による高尿酸血症の発症機序を解明するために、多くの試みが行われてきた。それにもかかわらず、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼの欠損により、プリン塩基とATPの分解が促進されるレッシュ・ナイハン症候群などのいくつかの尿酸代謝異常を除けば29、尿酸の産生過剰の正確な機構を明らかにすることに成功した研究はない。今回の研究結果は、「産生過剰」による高尿酸血症の主な原因が、実は尿酸の産生過剰ではなく、ABCG2のよくある機能低下による「腎外尿酸排泄」の低下によることを示している。また、これまでの分類における「産生過剰」による高尿酸血症は、UUEの高値のみで定義されており、正しい病態生理学的条件が加味されていなかったため、高尿酸血症の再分類が必要であると提唱する。つまり、今回の結果は、高尿酸血症のこれまでの分類における「産生過剰型」は、「腎外排泄低下」と真の「産生過剰型」のサブタイプを含む「腎負荷型」に改名すべきである(Fig. 4)という考えを支持している。

本研究では、ABCG2機能低下による腎外排泄の低下が、高尿酸血症の一般的な機序であることを提唱している。したがって、ABCG2は、尿路結石症のような副作用を起こさない痛風・高尿酸血症治療薬の有望な標的となりうる。我々の知見と提案は、長い間誤解されてきた高尿酸血症の病態生理学的概念の修正を勧めるものである。この新たな概念は、高尿酸血症の原因をより的確に突き止め、高尿酸血症と痛風に対するより効果的な治療方針を提示するために役立ち、ひいては、ありふれた疾患(common disease)に対する個別化医療のよいモデルになるだろう。

Methods

被検者

本研究は各研究機関の倫理審査委員会により認可されており、本研究におけるすべての手法は、ヘルシンキ宣言にのっとって行われた。SUAが7.0 mg dl−1よりも高いとき高尿酸血症患者と診断し、痛風症例についても、米国リウマチ学会が定めた基準30に従って、原発性痛風の臨床診断を行った。すべての高尿酸血症および一次性痛風の症例は、東京慈恵会医科大学附属病院(東京都)またはみどりヶ丘病院(大阪府)の痛風外来において、文書による同意を得た。ただし、Supplementary Table S1 で示す臨床パラメーター情報のない患者や、レッシュ・ナイハン症候群を含む遺伝性代謝障害を持つ患者はその対象から除外した。最終的に、575例の痛風を含む644例の男性外来患者が、有効な高尿酸血症の被検者として登録された。

尿酸動態に対する臨床パラメーター

SUA、UUEの量、尿酸クリアランスの分画排泄率(urate clearance/creatinine clearance ratio, FEUA)をはじめとする臨床パラメーターは、それぞれの患者に対して、低プリンおよび低カロリー食、およびフルクトースやアルコールの摂取に関する食事指導を行った後に計測した31,32。本研究では、高尿酸血症に対する投薬を行う前の臨床パラメーターを用いた。UUEとFEUAは、いずれも数時間の蓄尿後に計測した。UUEは、体表面積1.73 m2で標準化した。本研究では、患者のUUEが2.5 mg h−1/1.73 m2(一日当たり600 mg/1.73 m2)より大きいとき、産生過剰による高尿酸血症と分類した7,8,33。FEUAの正常値範囲が5.5–11.1%であるため35、FEUAが5.5%未満のときに、排泄低下型と分類した34。UUEとFEUAが、産生過剰および排泄低下型高尿酸血症の基準を両方とも満たしたとき、混合型に分類した(Fig. 1)。産生過剰による高尿酸血症の基準のみに合うが、混合型には含まれない患者を、産生過剰型と定義した。

遺伝学的解析

ゲノムDNAは、末梢全血細胞から抽出した36。遺伝子型の判定は、LightCyler 480(Roche Diagnostics)21による高解像度融解曲線解析、または7700 detector(Applied Biosystems)37を用いた対立遺伝子識別解析(Custom Taqman MGB, Applied Biosystems)により行った。遺伝子型を確定するために、Supplementary Table S5 に示したプライマーを用いて、100例以上の検体について直接塩基配列を確認した。DNA塩基配列解析は、3130×l Genetic Analyzer(Applied Biosystems)21を用いて行った。そして、ABCG2変異のrs72552713(Q126X)とrs2231142(Q141K)の組み合わせから、ABCG2の排泄機能を推定し、以下の4つの機能グループに分けた21。すなわち、完全機能型、3/4機能型(軽度の機能低下)、1/2機能型(中程度の機能低下)、および ≤ 1/4機能型(重度の機能低下)である。

尿酸排泄経路の実験的評価

マウスAbcg2のcDNA(GenBank accession number NM_011920)は、pcDNA3.1(+)ベクタープラスミド(Invitrogen)のNot Iサイトに挿入し、mycタグ配列を5′末端に付加した。野生型のヒトABCG2 cDNA(GenBank accession number NM_004827)と、変異型(Q126XおよびQ141K)ABCG2 cDNAは、pcDNA3.1(+)ベクタープラスミドのNhe IとApa Iサイトに挿入し、mycタグ配列を5′末端に付加した21。膜小胞を調製するために、Abcg2/ABCG2を発現するベクター、あるいは空のベクター(対照実験)を、FuGENE6(Roche Diagnostics)を用いて、付属の説明書に従いHEK293細胞に一過的に導入した。48時間後に細胞を回収し、遠心とホモジェナイズを繰り返し、常法で細胞膜小胞を単離した38。ウェスタンブロット解析でAbcg2タンパク質の発現を確認した後、細胞膜小胞を用いた標準的な輸送実験を行い、[14C]尿酸(28 µM, American Radiolabeled Chemicals)の輸送活性を評価した39。本研究で用いたほかのすべての化学物質は、市販されている試薬用のものである。

以前の報告に従い、体重27–33 gの雄のAbcg2ノックアウトマウス(FVB.129P2-Abcg2, Taconic)と対照群のFVBマウスに対して、2.0%(w/w)のオキソン酸カリウムを一週間以上食べさせた40。採取した血清と尿サンプル中の尿酸とクレアチニン濃度は、QuantiChrom Uric Acid Assay Kit(Bioassay systems)とCreatinine Assay Kit(Cayman Chemical Company)を用いて測定した。腸管尿酸排泄の解析には、一晩絶食させたマウスをウレタンの腹腔内注入により麻酔し、十二指腸の上部と空腸の中部にポリエチレンチューブ(Hibiki Size 8)(Kunii Co.)を挿入して、腸の上半分で腸管のループを形成した。生理食塩水と空気をゆっくりと注入して腸の内容物を除いた後に、輸送バッファー(0.3 mMオキソン酸カリウムを含む生理食塩水)を腸管ループに導入し、ループの両端をシリンジで閉じた。図に示した時間の後、ループ中の輸送バッファーをシリンジで回収し、尿酸濃度を定量した。腸管尿酸排泄は以下の方程式で計算した。

[腸管尿酸排泄] = [腸管ループ中の尿酸濃度]×[腸管ループ中の輸送バッファー量]×[小腸の全長]/[腸管ループの長さ]

胆汁の尿酸排泄を調べるために、ウレタンの腹腔内投与によりマウスを麻酔し、Teflon catheter(UT-03)(Unique Medical)を用いて胆嚢管を結紮し、一般的な胆管瘻を作製した。肝内胆汁サンプル中の尿酸の回収は3時間行い、検査した。尿中、腸管、胆汁の各排泄経路の相対的な寄与は、一日の尿量を2 mlと仮定して、それぞれの経路の算出された速度の比較から見積もった。行われた手法は、実験動物の人道的処置の承認基準に従っており、当該研究所の動物実験審査委員会により承認されている。

ウェスタンブロット解析

ウェスタンブロット解析では、2×SDS泳動バッファーに希釈した5 µgの膜小胞を、3.75%スタッキングゲルのある10%のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動板に展開した。タンパク質は、ブロット装置(Bio-Rad Laboratories)で15 V、1時間の条件で電気的にImmobilonメンブレン(Millipore)に転写した。メンブレンは、0.05% Tween 20と3%ウシ血清アルブミン(BSA)を含むトリス緩衝生理食塩水(TBS-T)で、室温で1時間ブロッキングした。TBS-Tで洗浄後、ABCG2の検出用に、0.1% BSAと抗ABCG2/BCRP抗体(BCP-53, Abcam)(1:500, 0.5 µg ml−1)でメンブレンを1時間室温で保温した。膜タンパク質の泳動量指標には、抗Na+/K+ ATPアーゼ α抗体(Santa Cruz Biotechnology)(1:200, 1.0 µg ml−1)を用いた。その後、メンブレンをセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識した二次抗体(GE Healthcare)を0.1% BSAを含むTBS-Tで5,000倍に希釈して、室温で1時間結合させ、ECL Prime Western Blotting Detection System(GE Healthcare)とluminescent image analyzer(Bio-Rad)を用いて検出した。

経腸管尿酸輸送実験

尿酸の腸管輸送を示すために、マウス腸管サンプルの上3分の1を回収し、内容物を丁寧に除去した。次に、サンプルの両端をシリンジでつなぎ、内腔側を5 mlのリンガーバッファー(93.4 mM NaCl, 6.2 mM KCl, 2.0 mM KH2PO4, 1.2 mM MgSO4-7H2O, 2.5 mM CaCl2-2H2O, pH 7.4, 37°C)で満たした。続いて、[14C]尿酸(0.4 µM)を含むリンガーバッファー(pH 7.4、37°C)で、そのサンプルを保温した。このバッファーは事前に混合気体(95% O2 and 5% CO2)で30分間処理しておいた。図に示した時間後、内腔内のバッファーを200 µlサンプリングし、等量のバッファーを追加した。シリンジは2.5分ごとにゆっくり動かし、内腔内のバッファーを完全に撹拌した(Supplementary Fig. S2)。

定量的リアルタイムPCR

尿酸輸送にかかわる遺伝子のメッセンジャーRNA量を決定するために、マウス腎臓のサンプルをRNAiso plus(Takara)中でホモジェナイズし、抽出したRNAをReverTra Ace(Toyobo)を用いて逆転写した。定量的リアルタムPCRには、2×SYBR GREEN(Stratagene)とChromo4(BIO-RAD)を用いた。条件は95°Cで10分間保温後、95°C 15秒間、50°C 30秒間、72°C 40秒間のサイクルを40回行った。使用したプライマーは以下のとおり。Abcg2(センス鎖 5′-aagcatagggatggagctga-3′、アンチセンス鎖 5′-ctgtgcttgagtccaaacca-3′)、Urat1(センス鎖 5′-atcatctccatgctgtgctg-3′、アンチセンス鎖 5′-aagtccacaatcccgatgag-3′)、Glut9(センス鎖 5′-cggcctggctctcaaacttcgccg-3′、アンチセンス鎖 5′-ggcgaagacgaggaagcagt-3′)、Pdzk1(センス鎖 5′-atataatgcctcagggcgtg-3′、アンチセンス鎖 5′-atggctggcgttctctacat-3′)、β-actin(センス鎖 5′-ccggaaggaaaactgacagc-3′、アンチセンス鎖 5′-gtggtggtgaagctgtagcc-3′)。

統計分析

ハプロタイプ推定には、EMアルゴリズムを用いた41。ABCG2機能とUUEの関連を調べるために、UUEを従属変数として、ABCG2の推定機能を独立変数として用い、単純線形回帰分析を行った。ABCG2機能と産生過剰型高尿酸血症との関連を評価するために、それぞれの機能カテゴリーでの産生過剰型高尿酸血症の割合を、完全機能カテゴリーでのそれで割って、リスク比(RR)とその95% CIを求めた。産生過剰型高尿酸血症に対するABCG2機能低下の補正RRを得るために、ポアソン回帰分析を行った。考えられる交絡因子として、body mass index(BMI)、アルコール摂取、尿酸関連遺伝子の一塩基多型(rs11722228(GLUT9/SLC2A918、rs506338(URAT1/SLC22A1218、rs12129861(PDZK117)を用いた。今回の統計分析で行ったすべての計算は、ソフトウェアR(バージョン2.8.1)(http://www.r-project.org/)とSPSS(Windows版バージョン16.0J)(SPSS)を用いて行った。

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